在此前的两篇文章《叮咚！收下这份慢病毒包装的全攻略》和《慢病毒稳转细胞株的构建》中，我们探讨了慢病毒如何有效地将外源基因整合到宿主染色体上，实现长期表达。慢病毒具有广泛的感染能力，几乎可以感染所有哺乳动物细胞、干细胞及原代细胞。得益于这些优势，慢病毒已成为一种强大的基因传递工具，并广泛应用于生物医学研究。

一、病毒的储存

建议将包装好的慢病毒分装后，存放在-80℃的冰箱中，保存期限为六个月。如果超过这个时间，建议在使用前重新测定病毒滴度。如果实验在短时间内（3-5天）进行，也可以选择在4℃中保存病毒。同时，应尽量避免反复冻融，以防降低病毒滴度。可以根据每次实验的需要进行分装。

二、病毒的稀释

如需稀释病毒，应先将病毒进行冰浴融化，然后用PBS或不含血清的培养基进行稀释，混匀后在4℃保存。为了确保病毒的滴度，建议在三天内使用完毕。

三、预实验及感染步骤

在正式实验前，需要进行预实验以确定慢病毒对目标细胞的感染复数（MOI）及最佳感染条件，例如接种的细胞数量、感染时的总体积和换液时间。第一天，将生长良好的细胞接种于96孔板中，培养过夜。第二天，冻结的病毒取出并融化后，根据预实验确定的MOI值，设置梯度范围，通常为3-100。然后，根据预设的MOI值计算每孔需要添加的病毒原液量。

第三天，需更换培养液，将含有慢病毒的培养液更换为正常的培养液，继续培养。接着，在感染后的48-72小时，使用倒置荧光显微镜观察目标细胞的荧光，评估慢病毒感染效率，并确定适合的MOI值用于正式实验。

四、正式感染步骤

抗生素筛选是实现稳定转染的重要步骤。在感染有效的细胞后，细胞可在含有特定浓度抗生素的培养基中存活，而未感染的细胞则会死亡。这种方法可以在抗性筛选下筛选出稳定表达目标基因的细胞株。例如，感染后的细胞在抗生素培养液中继续培养，并每3-4天更换一次培养液，直到未感染的对照组细胞被抗生素杀死，感染组细胞无死亡现象。

五、稳转株的构建及保存

在筛选出稳定转染的细胞后，可以选择建立多克隆或单克隆稳定转株。对于多克隆稳转株筛选，初步降低抗生素浓度至维持浓度，并对细胞继续筛选扩增，随后进行目标基因表达水平的鉴定。单克隆筛选则是稀释培养感染的细胞，挑选出单个细胞生长的细胞克隆并进行扩大培养，最终选择稳定性高、特征单一的细胞株进行进一步存储。

对于生物医学研究，慢病毒的应用意义重大，帮助研究人员探索更多疾病机制与治疗方案。通过上述流程，助力科研工作者在基因治疗和细胞工程领域取得更多进展。

人生就是博，探索未知，让科学成为可能！